Optimierung bequemer Echtzeit-PCR-Maschinen

Wenn es sich um Echtzeit-Fluoreszenz quantitative PCR für die Quantifizierung der Virus und die SNP-Genotypisierung handelt, benötigen wir eine PCR-Maschine mit der höchstmöglichen Spezifität. Wenn es sich um einen Erreger und mRNA -Nachweis handelt, brauchen wir eine hohe Empfindlichkeit PCR -MaschineWie sollen wir diese PCR -Maschine optimieren?

Hier ist die Inhaltsliste:

l Verbesserung der Effizienz der PCR -Maschinenverstärkung

l Echtzeit-PCR-Maschinenprimer für allgemeine PCR verwenden

Verbesserung der Effizienz der PCR -Maschinenverstärkung

Sich verbessern die PCR -Maschine Amplifikationseffizienz, Spezifität und Empfindlichkeit können wir die quantitative PCR-Maschine in Echtzeit für das Experiment durch eine Reihe von Maßnahmen optimieren. Die erste ist die Auswahl der Zielsequenz.

1, Die Auswahl einer bequemen Echtzeit-PCR-Maschinenzielsequenz geeignete Länge zwischen 50 und 150 bp. Kürzere Sequenzen benötigen weniger Zeit, um zu synthetisieren und kürzere Verstärkungszeiten aufweisen, sodass die Möglichkeit einer Verstärkung der DNA reduziert wird.

2 Verwenden Sie bei der Auswahl der Zielsequenz die BLAST -Suche, um die Zielsequenz für Polymorphismen und Sequenzierungsfehler zu analysieren und sie zu vermeiden. Wenn in der Zielsequenz doppelte Sequenzen vorhanden sind, verringert dies die Erkennungsempfindlichkeit dieser PCR -Maschine und sollte ebenfalls vermieden werden.

3, steuern Sie den GC -Gehalt ≤ 60% in der Zielsequenz. Ein hoher GC-Gehalt beeinflusst die Denaturierung der Zielsequenz im Wärmezyklus, aber auch einfach zu erzeugen, dass diese nicht spezifische Amplifikation dieser PCR-Maschine erstellt wird.

4, vermeiden Sie eine sekundäre Struktur. Zielsequenzen mit umgekehrten Wiederholungssequenzen sind leicht zu einer sekundären Struktur zu erzeugen, die die Hybridisierung bequemer Echtzeit-PCR-Maschinenprimer und Sonden beeinflusst.

Darüber hinaus müssen wir auch sicherstellen, dass die Qualität der Vorlage die Verstärkung nicht beeinflusst, die Ergebnisse der bequemen Echtzeit-PCR-Maschine haben Zuverlässigkeit. Beispielsweise kann beschädigte DNA in der PCR -Maschine nicht angemessen verstärkt oder überhaupt nicht verstärkt werden. Auch das Vorhandensein von DNA -Polymerase -hemmenden Reagenzien (DMSO usw.) und Verunreinigungen (SDS usw.) in der Vorlage kann die Zuverlässigkeit der Ergebnisse der PCR -Maschinenverstärkung beeinflussen.

Verwenden von Echtzeit-PCR-Maschinenprimern für allgemeine PCR

Werden Sie bequeme Echtzeit PCR -Maschine Primer, diese Methode kann auch für die gewöhnliche PCR verwendet werden.

1, die Länge sollte 18-30 bp betragen, um die Spezifität der Bindung sicherzustellen.

2, die Schmelztemperatur (TM-Wert) sollte 55-60 ° C betragen, und die TM-Werte der beiden Primer sollten sich um 2-3 ° C unterscheiden.

3, jeder Primer sollte am 3'-Ende 1 bis 3 Guanine oder Cytosine haben, was die nicht spezifische Amplifikation während der PCR-Maschine in Echtzeit bequem reduzieren kann. Mehr als 3 werden nach hinten losgehen und einen "Gleiteffekt" verursachen, der zur falschen Erweiterung führt.

4. Der GC -Gehalt der Primer sollte bei etwa 50%betragen, und zu hoher GC -Gehalt erhöht den TM -Wert.

5, die PCR -Maschinenprimer sollten umgekehrte repetitive Sequenzen vermeiden, da sie eine sekundäre Struktur bildet und die Primerbindung auf der Vorlage beeinflusst.

6 Wenn es sich um RT-PCR handelt, müssen Sie auch vermeiden, dass Primer an Exon-Sequenzen gebunden werden, was zu experimentellen Ergebnissen falsch positiver PCR-Maschinen führt. Der korrekte Ansatz sollte auf der langen Intronflanke oder kurzen Introns oder über die Exon-Exon-Übergangsregion konzipiert sein.

7. Entsalzen und Reinigung der Primer.

Beachten Sie, dass die Primer manchmal, wenn Sie alle Punkte getan haben, möglicherweise nicht verstärkt, sodass Sie die Primer neu gestalten sollten.

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